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BRDU对研究细胞动力学有着重要意义
发布时间:2022-06-15   点击次数:69次

BRDU对研究细胞动力学有着重要意义


Brdu是一种合成的胸苷类似物,在DNA复制的S期可替代胸腺嘧啶核苷选择性结合到细胞DNA中。从而检测细胞DNA合成和标记细胞分裂,凋亡等行为。在遗传研究中Brdu可通过活体注射或细胞培养添加,然后使用抗Brdu的单克隆抗体进行特异性标记,ICC或IHC法染色显示增殖细胞。另外,还能同时结合其它细胞标记物,双重染色,来判断增殖细胞的种类,增殖速度等,对研究细胞动力学有着重要意义。


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使用方法

1. Brdu配制

用1X DPBS充分溶解适量的Brdu配置成浓度为10 mg/ml的母液,0.22um滤器过滤除菌后,按照0.5ml/管的量分装放在-20℃或者-80℃长期保存,避免反复冻融。Brdu储存液再融化后,4℃可稳定存放一周。

2. 在体Brdu标记

腹腔注射法(常用):无菌的10 mg/ml(溶于DPBS)适合用于体内注射用。按照100-200μl(1-2 mg)Brdu的量腹腔注射到小鼠体内。注意:一般注射后0.5 h后在小肠、胸腺和骨髓瘤处就能检测到Brdu。在注射后24 h内几乎所有组织都能检测到Brdu。根据自身的实验体系,在合适的时间点处死动物,摘除待研究的组织。使用冰冻切片或者石蜡包埋的方法进行组织处理和切片制备。然后进入后续的IHC染色步骤。

3. 体外Brdu标记(培养原代细胞或者细胞系)

推荐使用浓度:10 μM Brdu(稀释于培养液)

1)在96孔板上按标准步骤进行细胞培养;

2)Brdu工作液的准备:用组织细胞培养液按照1:30的比例稀释储存液得到1mM Brdu工作液。然后取10μl  1 mM Brdu溶液直接加入1 ml培养液即得到10 μM  Brdu工作液。

3)按100 μl/孔Brdu工作液的量进行细胞标记,37℃孵育60 min~过夜。同时设置非Brdu标记的细胞作为阴性对照。注意:最佳的孵育时间取决于细胞增殖速度以及需要达到的实验目的。比如,对于快速增殖细胞(如HL-60)有效孵育时间为30-45min;对于原代细胞(如未受外源刺激培养的外周血淋巴细胞)孵育时间可能需要24 h。细胞密度需小于2x106 /ml。

4)制备单细胞层玻片,使用以下任何一种方法:

a.细胞离心涂片制备:使用细胞离心涂片机,将100μl标记好的细胞(浓度为:1-2x106 /ml)直接离心poly-L-lysinee包被的玻片上,风干。

b.细胞涂片制备:取一小滴标记好的细胞悬液于poly-L-lysine包被玻片的一端,然后用第二个干净玻片将其均匀涂布成一薄层。室温风干。

5)将玻片置于70%冰乙醇放在-20℃下固定20-30 min。

6)PBS清洗细胞3次,每次5min。

7)加入1.5M HCl中室温孵育30 min。注意:DNA的变性对于Brdu染色的成功至关重要。

8)吸去HCl,PBS清洗2次,每次5min。

9)进入后续ICC染色步骤。

4. 体外Brdu标记(组织薄片)

1)Brdu工作液的准备:用组织细胞培养液按照1:30的比例稀释储存液得到1mM Brdu工作液。然后取10 -20μl 1 mM Brdu溶液直接加入1 ml组织培养液即得到最终工作液。确保有足够的工作液(37℃温热)完全浸泡组织。

2)在温热的培养基内进行组织切片,注意维持组织的活力。

3)转移组织薄片至预装有10 ml Brdu标记液的15 ml离心管内。置于37℃,CO2 培养箱内孵育。孵育时间取决于组织薄片类型以及需要达到的实验目的(常用的为2-4 h)。

4)37℃ PBS清洗组织薄片,每次5 min。

5)使用标准的冰冻切片或者石蜡包埋切片的方法固定组织并进行后续其它染色标记。


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