血清总补体溶血活性(CH50)测定方法
一、原理
利用绵羊细胞与相应抗体(溶血素)结合成的复合物,可激活血清中的补体,导致红细胞溶解,当红细胞和溶血素量一定时,在规定反应的时间内,溶血程度与补体量及活性呈正相关。在接近50%溶血(CH50)时,二者之间近似直线关系,故以50%溶血作为最敏感的判断终点。以引起50%溶血所需的最小补体量为一个CH50U,可计算出待测血清中总的补体溶血活性,以CH50U/ml表示。
本实验主要反映补体经典活化途径的溶血功能,其结果与补体C1~C9各组成分的量及活性均有关。
二、试剂及配制
1.缓冲生理盐水:
(1)贮存液:
Na2HPO4.12H2O 2.85g
KH2PO4 0.27g
NaCl 17.00g
蒸馏水定容至100ml,4℃保存备用
(2)应用液:5ml贮存液加95ml蒸馏水,再加10%硫酸镁0.1ml,当日配制,12小时内使用。
2.2%绵羊红细胞:无菌采取绵羊血液,于等量Alsever液中可保存3周。用前以缓冲液洗3次,并配成2%细胞悬液。必要时可用吸光光度法或细胞计数法使悬液细胞浓度标 准化。
3.溶血素:将绵羊红细胞溶血素(效价1:4000),用应用液做1:2000倍稀释(即1ml溶血素加1999ml应用液)。
4.待测血清:新鲜血液室温放置30min,再4℃放置60min,使血块收缩,4℃离心(3000r/min)10min,取上清,-20℃保存。
三、操作步骤
试管法(改良Mayer法)
1.致敏羊红细胞:2%绵羊红细胞加等量稀释后的溶血素(1:2000),混匀,置37℃水浴30min。
2.稀释血清:待测血清0.2ml,加应用液3.8ml,稀释度为1:20。
3.配制溶血标准管:全溶血管:2%绵羊红细胞2ml加8ml蒸馏水,混匀。50%溶血管:取全溶血管液2ml加缓冲液2ml。
4.按表所示,依次加各成分于试管中,混匀,置37℃水浴30min,第10管为非溶血对照:
补体CH50测定试管法
成 分 | 试 管 号 | |||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
1:20待测血清(ml) | 0.10 | 0.15 | 0.20 | 0.25 | 0.30 | 0.35 | 0.40 | 0.45 | 0.50 | - |
应用液(ml) | 1.40 | 1.35 | 1.30 | 1.25 | 1.20 | 1.15 | 1.10 | 1.05 | 1.00 | 1.50 |
致敏红细胞(ml) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
5.结果测定:取出试管,2000r/min离心10min,对照管应不溶血。肉眼比色,选与50%溶血标准管相近二管,再用分光光度计测(波长542nm、0.5cm比色杯)OD值,确定与标准管最接近者为终点管,然后按下公式计算CH50值:血清补体CH50(U/ml)=(1/血清用量)×稀释度。
如第5管为终点管,测待测血清中CH50为66.7U/ml。血清补体CH50正常值为50-100U/ml。
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