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原位杂交实验邮寄样本的注意事项
更新时间:2023-11-03   点击次数:200次
  原位杂交实验邮寄样本的注意事项
 
  原位杂交已成为当今细胞生物学、分子生物学、病理学研究的重要手段。
 
  信帆生物,可进行mRNA, lncRNA, circRNA, micRNA等各类RNA分子和DNA的原位杂交检测。
 
  可接收石蜡切片、冰冻切片、细胞爬片等实验样本,可以做DAB,NBT,荧光单标,双标,三标等不同显色系统的检测。
 
  原位杂交实验的送样要求
 
  1、切片前处理要求
 
  新鲜组织干冰运输后做冰冻切片;或取2mm左右厚度的新鲜组织,5min内投入原位杂交固定液内固定,4℃低温保存运输,切勿冷冻结冰;尽快包埋切片后进行原位杂交实验,固定时间过长影响核酸检出率;
 
  2、冰冻切片
 
  冰冻切片-20℃运输;
 
  3、石蜡切片
 
  石蜡切片常温运输;
 
  4、 细胞爬片
 
  细胞爬片加原位杂交固定液固定15min后,换无酶PBS,密封,4℃运输。
 
  石蜡切片 荧光原位杂交 实验流程
 
  下面以石蜡切片荧光原位杂交为例来具体介绍一下原位杂交的实验流程(具体实验参数可根据实验需求进行调整优化)。
 
  1
 
  石蜡切片脱蜡至水
 
  依次将切片放入环保型脱蜡透明液Ⅰ(货号G1128,15 min)-环保型脱蜡透明液Ⅱ(货号G1128,15 min)-无水乙醇Ⅰ(5 min)-无水乙醇Ⅱ(5 min)-85%酒精(5 min)-75%酒精(5 min)-无酶水(货号:G4700)。
 
  2
 
  修复
 
  组织切片浸没于1×修复液(货号:G1202)中,加热修复(如用微波炉加热,可中火7分钟,停火7分钟,中低火6分钟)。
 
  3
 
  消化
 
  组化笔(货号:G6100)画圈,将蛋白酶K(货号G1234)稀释至20μg/mL滴加到组织上,再放入恒温箱40℃消化20-30min,接着用无核酸酶PBS缓冲液(货号:G4202)洗3次,每次5min(最优消化条件需根据实际实验情况进行优化调整,以获得最佳实验效果)。
 
  4
 
  预杂交
 
  轻轻甩干切片,滴加40℃预热的杂交液覆盖组织,放入恒温箱40℃孵育30 min。
 
  5
 
  杂交1
 
  倒掉杂交液,滴加60 μL 40℃预热的探针混合物1杂交液,水平置于湿盒再放入恒温箱40℃孵育3h。(注意防止干片。做多标时可同时添加不同靶标的探针混合物1进行杂交。赛维尔生物提供探针合成服务)
 
  6
 
  杂交后洗涤
 
  倒掉杂交液,将切片依次用40℃预热的2× SSC、1× SSC、0.5× SSC、0.1× SSC(20×SSC缓冲液,货号:G3015,用无核酸酶水稀释)各漂洗5 min(如非特异性杂交体较多,可以在此步增加洗涤时间、次数及调整杂交液中甲酰胺浓度)。
 
  7
 
  杂交2
 
  轻轻甩干切片,滴加60 μL 40℃预热的探针混合物2杂交液,水平置于湿盒再放入恒温箱40℃杂交45 min(此过程中可在湿盒底部加入50ml 2× SSC,防止干片。做多标时可同时添加不同靶标的探针混合物2进行杂交)。
 
  8
 
  杂交后洗涤
 
  同第6步
 
  9
 
  信号杂交
 
  轻轻甩干切片,滴加60 μL 40℃预热的信号探针杂交液,水平置于湿盒再放入恒温箱40℃杂交45 min(此过程中可在湿盒底部加入50ml 2× SSC,防止干片。做多标时可同时添加不同信号探针进行杂交)。
 
  10
 
  杂交后洗涤
 
  同第6步
 
  根据不同的信号探针,选用不同的显色系统,本次是荧光探针,所以进行DAPI染色:
 
  11
 
  DAPI染核
 
  切片用无核酸酶的PBS缓冲液(货号:G4202)润洗,切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染色试剂(货号:G1012),避光室温孵育8 min。
 
  12
 
  封片
 
  切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂(货号:G1401)封片。
 
  13
 
  图像采集分析
 
  最后进行镜检拍照,或荧光共聚焦拍照(可选),或切片扫描(可选)。
 
  原位杂交实验邮寄样本的注意事项
 
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