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谷丙转氨酶(ALT/GPT)测试盒的测定原理
更新时间:2023-12-06   点击次数:89次

 谷丙转氨酶(ALT/GPT)测试盒的测定原理

微板法)

一、测定原理:

谷丙转氨酶(ALT)在 37℃及 PH7.4 条件下,作用于丙

氨酸及α-酮戊二酸组成的底物,生成丙酮酸及谷氨酸。反应

30min 后(固定时间)加入 2,4-二硝基苯肼(DNPH)盐酸溶

液,既中止反应,同时 DNPH 与酮酸中羰基加成,生成丙酮

酸苯腙。苯腙在碱性条件下呈红棕色,于 505nm 比读吸光度

并计算酶活力。

二、试剂的组成与配制:(96T)

试剂一:谷丙转氨酶基质液,5mL×1 瓶,4℃冰箱保存 个月;

试剂二:2,4—二硝基苯肼液,5mL×1 瓶,4℃冰箱保存 个月;

试剂三:4mol/L 氢氧化钠液,5mL×1 瓶,室温密封保存 个月;

0.4mol/L 氢氧化钠液的配制,临用时按 4mol/L 氢氧化钠液:

蒸水=1的比例稀释,需多少配多少,室温密封保存。

试剂四:2mmol/mL 丙酮酸钠标准液×1 支,4℃冰箱保存 个月;

试剂五:0.1mol/L 磷酸盐缓冲液×1 支,4℃冰箱保存 个月。

三、操作过程:

1、样本前处理:

①、血清(浆)及其它液体样本待测:直接测定。

②、动物组织样本:准确称取组织重量,按重量(g):体积

(mL)=1:9 的比例,加入 倍体积的生理盐水,冰水浴条件

下机械匀浆,2500 /分,离心 10 分钟,取上清液待测。

③、培养细胞样本前处理:将收集好的细胞用等渗缓冲液(推

 0.1mol/L pH77.4 磷酸盐缓冲液或生理盐水)清洗 1

次;1000 /,离心 10 分钟,弃上清,留细胞沉淀,加入匀

浆介质(推荐加入 0.1mol/L pH77.4 磷酸盐缓冲液或生

理盐水),冰水浴条件下超声破碎或手动匀浆,制备好的

匀浆液不离心,待测。

2、操作表:

 

1比色法中常用的有赖氏(Reitman-Frankel)法及金氏(King

法。赖氏法标准曲线所定单位数,是用实验方法和卡门氏分

光度法(速率法)作对比测定求得的。以卡门氏单位报

告结果,比较准确。

卡门氏单位定义1mL 液体,反应液总容量 3mL,波长 340nm

1cm 光径,25℃,1min 内所生成的丙酮酸,使 NADH 氧化

 NAD+而引起吸光度每下降 0.001 为一个单位(卡门氏

单位=0.482 U/L25℃)。

2一般血清标本内源性酮酸很少,血清对照孔吸光度值接近试

剂空白孔(以双蒸水代替血清,其他和对照孔同样操作)。

所以,成批标本测定时,一般不需要每一标本都作本身血清

对照孔,以试剂空白孔代替即可,但对脂血、黄疸或溶血血

清,每份标本应作对照孔。

3酶活力超过 150 卡门氏单位时,用生理盐水稀释血清后重测。

4应将一般血清的对照孔(或称标本空白孔)的吸光度作为日

常质控的指标之一;如相差大,可考虑α-酮戊二酸浓度、DNPH

浓度及仪器等原因引起。

5血清中 ALT 在室温(25℃)可保存 天,在 04℃可保存一

周,在-25℃可保存 个月。

附录Ⅰ:ALT 标准曲线

1、操作表:

 

附录Ⅱ:组织中 ALT 测定

1、样本前处理:

准确称取组织重量,按重量(g):体积(mL)=1:9 的比例,加入 倍体

积的生理盐水,冰水浴条件下机械匀浆,制成 10%的组织匀浆,2500

/,离心10分钟,取上清液,再用生理盐水稀释到适宜浓度(通过标

准曲线后计算得匀浆液卡门氏单位值小于 150)待测。(取部分上清

液测蛋白浓度,蛋白定量试剂盒本所有售)

2、操作表:

组织中 活力通过标准曲线得 ¸待测匀浆液蛋白

匀浆液ALT活力 浓度

附录Ⅲ:血清(浆)中 ALT 测定

1、前处理:

血清()直接取样进行测定。(若酶活力超过 150 卡门氏单位

时,需用生理盐水稀释血清后重新测定)

2、操作表:

 

 谷丙转氨酶(ALT/GPT)测试盒的测定原理

 


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