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辅酶 I NAD(H)测定试剂盒NAD + 的提取
更新时间:2023-12-15   点击次数:74次

 辅酶 I NAD(H)测定试剂盒NAD + 的提取

(分光光度法,50T/24 样)

一、 测定意义:

辅酶 I NAD(H) 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞

中,NAD 是糖酵解(EMP)和三羧酸循环(TCA)的主要

氢受体,生成的 NADH 经电子传递链(又称呼吸链,ETC

传递把电子交给氧,在合成 ATP 的同时,形成大量的活性

氧(ROS),同时 NADH 再生为 NAD +。糖、脂、蛋白质三

大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完

成。NAD(H)含量及 NADH/NAD +比值的高低可用于评价糖酵

解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H) NADH/NAD +比值说

明细胞呼吸耗氧量较高,处于过氧化状态。此外 NADH/NAD +

比值升高液可抑制糖酵解和 TCA 循环。另外,NAD +降解产

物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作

用。

二、 测定原理:

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD  NADHNADH

通过 PMS 的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT)为甲䐶

Formazan),在 570nm 下检测吸光值;而 NAD 可被乙

醇脱氢酶还原为 NADH,进一步采用 MTT 还原法检测。

三、 需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、移液器、1mL 比色皿、研

钵、冰和蒸馏水

五、 NAD  NADH 提取:

1. 血清(浆)中 NAD  NADH 的提取

NAD 的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体

积(mL)为15-10 的比例(建议取约0.1mL 血清(浆),

加入1mL 酸性提取液),煮沸5min(盖紧,以防止水分散失);

冰浴中冷却后,10000g 4 离心10min;取上清液至另一新

的离心管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,

10000g 4 离心10min,取上清,置冰上待测。

NADH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体

积(mL)为15-10 的比例(建议取约0.1mL 血清(浆),

加入1mL 碱性提取液),煮沸5min(盖紧,以防止水分散失);

冰浴中冷却后,10000g 4 离心10min;取上清液至另一新

的离心管中,加入等体积的酸性提取液使之中和,混匀,

10000g 4 离心10min,取上清,置冰上待测。

2.

组织中 NAD  NADH 的提取

NAD 的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL

15-10 的比例(建议取约0.1g组织,加入1mL 酸性提取

液),冰浴研磨,煮沸5min(盖紧,以防止水分散失);冰

浴中冷却后,10000g 4 离心10min;取上清液至另一新的

离心管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,

10000g 4 离心10min,取上清,置冰上待测。

NADH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL

15-10 的比例(建议取约0.1g组织,加入1mL 碱性提取

液),冰浴研磨,煮沸5min(盖紧,以防止水分散失);冰

浴中冷却后,10000g 4 离心10min;取上清液至另一新的

离心管中,加入等体积的酸性提取液使之中和,混匀,

10000g 4 离心10min,取上清,置冰上待测。

3.

细胞或细菌中 NAD  NADH 的提取

NAD 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按

照细菌或细胞数量(10 个):酸性提取液体积(mL)为

500-1000的比例(建议500 万细菌或细胞加入1mL 

性提取液),超声波破碎1min(冰浴,强度20%或200W

超声2s,停1s),煮沸5min(盖紧,以防止水分散失);冰

浴中冷却后,10000g 4 离心10min;取上清液至另一新的

离心管中,加入等体积的碱性提取液使之中和,混匀,

10000g 4 离心10min,取上清,置冰上待测。

NADH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,

按照细菌或细胞数量(10 个):碱性提取液体积(mL)为

500-1000的比例(建议500 万细菌或细胞加入1mL 

性提取液),超声波破碎1min(冰浴,强度20%或200W

超声2s,停1s),煮沸5min(盖紧,以防止水分散失);冰

浴中冷却后,10000g 4 ℃离心10min;取上清液至另一新的

离心管中,加入等体积的酸性提取液使之中和,混匀,

10000g 4 ℃离心10min,取上清,置冰上待测。

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