PCR法支原体检测试剂盒介绍的太全面了,欢迎围观!
储存条件
该产品在常温下运输,收到产品后,请立即放-20 ℃冰箱低温保存。该条件下,至少2年内有效。
产品用途
《PCR法支原体检测试剂盒》可用于检测一切可能含支原体的样品,比如:(1)体外细胞培养的上清;(2)血清;(3)各种体液,如唾液、尿液、鼻腔分泌物等;(4)别的液体样品。本产品仅供研究使用。
产品简介
哺乳动物细胞的培养,支原体(Mycoplasma)污染是个世界性的问题。支原体污染几乎可以改变细胞的所有参数,导致实验结果的不准确、甚至*错误。从2013年开始,《Nature》期刊已正式要求投稿的文章,如涉及细胞培养都要进行支原体检测。相信会有越来越多的高水平期刊将做出同样的支原体检测要求。
培养法是相对可靠的支原体检测技术,但是该方法非常耗时的,需要数周,不适合作为细胞培养液中支原体污染的快速检测。此外,通过固体培养法无法检测污染细胞的一种zui常见的支原体,即猪鼻支原体(M.Hyorhinis)。这是因为猪鼻支原体无法在支原体固体培养基上形成可见的菌落。而猪鼻支原体约占所有支原体污染的20-50%。
有的实验室使用荧光染色法检测支原体,但是该方法灵敏度太低,当检测成阳性时,细胞经常已经严重污染。
目前,细胞培养液中支原体污染的检测通常使用的是PCR法。但是PCR法也有明显的缺点:(1)整个过程大约需要3个小时;(2)由于细胞培养数天后,培养液中经常含有严重抑制PCR扩增的代谢物,所以样品的前处理一般是PCR法*的环节;(3)PCR法的灵敏度有限,通常需要将培养液离心浓缩或者抽提DNA后再检测;(4)PCR产物的电泳,需要用到EB等潜在的致癌物质;(5)需要用到PCR仪、电泳槽、凝胶成像仪、离心机等仪器。
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试剂盒组成
检测过程:
待测样品的准备
为了准确判断细胞是否有支原体的污染,待测的细胞培养液样品来源于至少培养3天且汇合度在70-90%左右的细胞培养液上清(贴壁细胞)。悬浮培养的细胞也需要在换液传代后,至少让细胞生长3天再取培养液进行检测。取150 μL上述待测样品,在普通台式离心机上1200 rpm (大约150-200 g)离心5 min,取离心后的上清100 μL用于支原体检测,丢弃下层剩余的50 μL(含细胞沉淀)。收集并已经离心去除细胞的待测样品如果不立即检测,请放于-20℃或-80℃冰箱保存,不得放于室温或4℃冰箱。样品在-20℃至少可以保存一个月,在-80℃基本可以保存。
注意:本步骤的低速离心是为了去除哺乳动物细胞,以排除其不必要的干扰。所以离心力要严格控制在150-200 g,该离心力下,哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会。如果错误使用更高的离心力将可能导致支原体也被离心下来,从而导致假阴性。
PCR体系的配制
请按下表(表1)进行PCR体系(总体积25 μL)的配制:
表1.PCR扩增体系的配制
| Negative Control | Positive Control | Sample |
去离子水 | 17.5 μL | 15.5 μL | 15.5 μL |
10×Taq DNA 聚合酶缓冲液(含Mg2+) | 2.5 μL | 2.5 μL | 2.5 μL |
2.5 mM dNTP | 2.5 μL | 2.5 μL | 2.5 μL |
5 Units/μL Taq DNA 聚合酶 | 0.5 μL | 0.5 μL | 0.5 μL |
支原体引物和内参 | 2 μL | 2 μL | 2 μL |
阳性支原体DNA或待测样品 | - | 2 μL | 2 μL |
结果判断
PCR扩增的结果有可能出现以下几种情况(表2):
表2. PCR扩增的可能结果
| 电泳结果 | 电泳结果 | 电泳结果 | 电泳结果 | 电泳结果 | 电泳结果 |
586 bp内参条带 | ++ | - | + | ++ | ++ | - |
270 bp左右条带 | - | ++++ | +++ | ++ | + | - |
结果图示(见图1) | 泳道1 | 泳道2 | 泳道3 | 泳道4 | 泳道5 | 泳道6 |
支原体污染判断 | 阴性 | 极重度污染 | 重度污染 | 中度污染 | 轻度污染 | PCR被抑制 |
注:“-”代表没有条带;“+”代表有条带;“+”号越多代表条带越强。
图1. 支原体PCR扩增结果。586 bp条带为内参条带,270 bp左右的条带为支原体特异条带(各支原体的条带大小会略有不同,总体在260-280 bp)。随着支原体DNA模板的增加,270 bp左右的条带会逐渐增强而586 bp的内参条带会逐渐减弱,甚至消失。泳道1:阴性对照或者没有支原体污染的样品;泳道2:极重度支原体污染样品;泳道3:重度污染样品;泳道4:中度污染样品;泳道5:轻度污染样品;泳道6:PCR的扩增被细胞的代谢产物抑制,导致扩增失败。M:DNA marker.
注意事项
每次检测都应该设有阴性对照,作用有:
(1)由于有效的PCR扩增,阴性对照也会有一条586 bp的内参条带,这样可以保证本试剂盒含有的支原体引物和内参以及自己准备的Taq DNA 聚合酶,dNTP等试剂没有问题;
(2)只有当阴性对照的结果没有出现270 bp左右的支原体特异条带时,别的样品的结果才是可信的。
如果586 bp条带和270 bp左右的条带都没有出现(如图1,泳道6),在排除PCR试剂的问题后(即阴性对照可以正常扩增),说明该样品含有抑制PCR扩增的代谢产物。有关PCR的扩增会被细胞的代谢产物抑制的问题,Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit(货号MP0035)的PCR法支原体检测试剂盒说明书中也特别提到了这点,说明这是一个PCR法支原体检测中经常遇到的问题,其强烈建议用试剂盒进行DNA提取后再进行鉴定。这也是PCR法支原体检测的致命弱点。
为了克服该问题,以下问题必须注意:
(1)您购买的PCR法支原体检测试剂盒,其扩增产物中必须含有内参(Internal Contol)条带作为对照【本试剂盒的586 bp条带就是内参条带】。否则,如果没有内参作为对照,即使样品扩增后没有支原体特异条带,你也无法确定是因为样品确实没有支原体还是因为PCR被细胞的代谢产物抑制导致的假阴性。
(2)如果出现PCR的扩增被细胞的代谢产物抑制时,请使用血液基因组DNA抽提试剂盒,抽提支原体DNA后再进行PCR鉴定。
(3)同时使用本公司生物试剂的《一步法恒温支原体检测试剂盒》进行检测,经严格测试,该试剂盒的扩增不会被细胞的代谢产物抑制。
本试剂盒与Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit(货号MP0035)的设计原理一样,可以替代后者用于各类支原体的检测。
根据支原体DNA的序列,本试剂盒可以识别所有100多种至今已发现的支原体,具有广谱的识别能力。
如发现细胞被支原体污染,本公司提供细胞支原体清除和预防试剂。
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