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快速检测食品中黄曲-mei素
发布时间:2021-02-03   点击次数:383次

快速检测食品中黄曲-mei素

总黄曲霉--毒素(AFs)酶联免疫测试方法介绍
  一、黄曲-mei素afs快速检测的意义:黄曲霉-毒素是由曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的次级代谢产物。主要污染玉米、花生、坚果等。天然污染的黄曲霉-毒素以AFB1、AFB2、AFG1、AFG2为主,总黄曲霉-毒素一般指这四种毒素的总量。黄曲-霉毒素属于zui强烈的天然致癌物质,肝脏是其主要的靶器官,其中AFB1毒性zui强,具有*的急性毒性和致癌性。其检测方法主要有薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC),本试剂盒可以准确快速检测粮谷类和花生及饲料中的总黄曲-霉毒素。



二、黄曲-mei素测定原理:利用用固相酶联免疫吸附原理,利用间接竞争ELISA法进行测定。用抗原包被微孔板,加入黄曲-霉毒素B1标准品或样品、总黄曲霉-毒素单克隆抗体进行免疫反应后,将未与包被抗原结合的抗体洗去;再加入酶标记的抗鼠IgG抗体孵育,加入底物显色,终止液终止后,用酶标仪在450nm处测定OD值。

三、快速检测实验操作所需的试剂及材料:微孔板 包被有AFB1-BSA;5个浓度的AFB1标准溶液各(1mL)可直接使用;标准1:0ng/mL 可直接使用;标准2:1.0ng/mL可直接使用;标准3:2.0ng/mL 可直接使用;标准4:5.0ng/mL可直接使用;标准5:10.0ng/mL 可直接使用;AFS单克隆抗体溶液(6mL)可直接使用;酶标物(12mL)可直接使用;显色液(12mL);终止液(6mL);浓缩洗液(30mL) ;空白对照(6ml)微孔板酶标仪(含450nm):定量分析用;振荡器,粉碎机,微量移液器,量筒,漏斗和容量瓶,快速定性滤纸;试剂:氯化钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、去离子水或蒸馏水

四、检验操作注意事项:标准溶液中含有黄曲-霉毒素,应特别小心。使用过的玻璃容器及黄曲-霉毒素溶液zui-好用pH7的次氯酸溶液(10%v/v)浸泡过夜。终止液为0.5N硫酸,避免接触皮肤。不要交换使用不同批号盒中的试剂。

五、黄曲-mei素检验实验样品前处理:样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存,取5g粉碎的有代表性的样品,加1.25g氯化钠及25mL70% 甲醇-水,强力振荡3分钟;用快速定性滤纸过滤;取1mL滤液,用1%氯化钠溶液稀释10倍;取50μL稀释液进行分析;据需要可以增加样品量,但甲醇溶液的量也应相应增加。

六、检验实验注意事项和测定程序:每次加样后立即将所有试剂放回2-8 ℃,每步操作时间控制在5min内, 孵育过程中应避光。测定程序1. 取所需数量的板条插入微孔架,记录样品及标准的位置。2. 加入50mL标准品或处理好的样品到微孔,每个标准和样品必须使用新的吸头。3. 将50mL抗总黄曲-霉毒素单克隆抗体使用液加入到每个微孔(注意移液器管尖不要接触到放进孔中的液体,避免交叉污染),在适当位置孔加空白对照液100mL,37℃孵育90min。4. 甩掉孔中液体,用洗液洗涤微孔板3min×3次,zui后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。5. 每孔加入酶标物100mL,37℃孵育60min。6. 甩掉孔中液体,用洗液洗涤微孔板3min×3次,zui后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。7. 每孔加入显色液100mL(2滴),37℃孵育10 min -12min。8. 每孔加入终止液50mL(1滴),立即用酶标仪在波长为450nm处测定吸光度值(OD值)。

黄曲-霉毒素B1(AFB1)酶联免疫定量检测方法
一、黄曲-mei素含义和检测原理:黄曲-霉毒素是由曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉等产生的次级代谢产物,主要污染玉米、花生、坚果等。天然污染的黄曲-霉毒素以AFB1为主,AFB1属于强烈致癌物质,肝脏是其主要的靶器官,具有*的急性毒性和致癌性。AFB1检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和ELISA方法,本试剂盒是以应用单克隆抗体为基础的ELISA检测方法,可以准确快速检测粮谷类和花生及饲料中的AFB1。测定原理才采用固相酶联免疫吸附原理,利用间接竞争ELISA法进行测定。用抗原包被微孔板,加入AFB1标准品或样品、抗AFB1单克隆抗体进行孵育后,将未与包被抗原结合的抗体洗去;再加入酶标记的抗鼠IgG抗体孵育,加入显色液,经过终止液终止后,用酶标仪在450nm处测定OD值。

二、实验所需提供的耗材物品:微孔板包被有AFB1-BSA5个浓度的AFB1标准溶液(各0.5mL)。标准1:0ng/mL可直接使用;标准2:0.1ng/m可直接使用;标准3:0.2ng/mL可直接使用;标准4:0.5ng/m可直接使用;标准5:1.0ng/m可直接使用;抗AF B1单克隆抗体溶液(6mL)可直接使用;酶标物(12mL)可直接使用;显色液(12mL)可直接使用;终止液(6mL)可直接使用;浓缩洗液(30mL) 稀释使用;微孔板酶标仪(可于450nm处测定)、振荡器、粉碎机、微量移液器;量筒、漏斗、容量瓶、快速定性滤纸;氯化钠(分析纯)、甲醇(分析纯)、去离子水或蒸馏水。

三操作者注意事项:1、标准溶液中含有黄曲-霉毒素,应特别小心。2、使用过的玻璃容器及黄曲-霉毒素溶液zui-好用pH7的次氯酸溶液(10%v/v)浸泡过夜。3、终止液含有硫酸,避免接触皮肤。4、每次加样后立即将所有试剂放回2~8 ℃。5、每步加样时间应控制在5min内。6、孵育过程中应避光。不要交叉使用不同批号的试剂。实验试剂储存条件:保存试剂盒于2~8℃;不要冷冻.显色液对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下;将不用的微孔板放进原铝箔袋中,置2~8℃保存。

四、实验测试样品的处理:样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存;取5g粉碎的有代表性的样品,加1.25g氯化钠及25mL70%甲醇-水溶液;强力振荡3分钟;用快速定性滤纸过滤;取1mL滤液,加水4mL进行稀释;取50μL稀释液进行分析;根据需要可以增减样品量,但甲醇-水溶液的量也应相应增减。

五、检测实验中酶免疫分析程序:1、浓缩洗液为10倍浓缩液,使用时与去离子水或蒸馏水按体积比1:9稀释后使用。2、取所需数量的板条插入微孔架,用洗液洗涤微孔板3min×2次。3、加入50mL标准品或处理好的样品到微孔,记录样品及标准的位置,每个标准和样品必须使用新的吸头。4、加入50mL抗体溶液到每个微孔(注意移液器管尖不要接触到孔中的液体,避免交叉污染)中,37℃孵育90min。甩掉孔中液体,用洗液洗涤微孔板3min×3次,zui后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。每孔加入酶标物100mL,37℃孵育60min。用洗液洗涤微孔板3min×5次,zui后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。5、每孔加入显色液100mL(2滴),37℃孵育10~12min。6、每孔加入终止液50mL(1滴),立即用酶标仪在波长450nm处测定吸光度值(OD值)。在定量分析中,显色液和终止液需要用移液器准确量取。

六、黄曲-mei素检验实验样品浓度计算方法:以标准溶液OD值与标准1OD值的比值为纵坐标,所对应标准溶液浓度(ng/mL)的对数值为横坐标,制作标准曲线。根据样品OD值与标准1OD的比值,可从曲线上得到对应点的横坐标,即为AFB1浓度的对数值,求得反对数即为测定液中AFB1浓度C(ng/mL),按下列公式计算出样品中AFB1含量:AFB1含量(mg/kg)= C×K式中:C:稀释后样品提取液中AFB1含量(ng/mL)K:样品稀释倍数(按照本说明书中样品处理程序方法为25)

七、试剂主要技术指标及参数

测试盒zui低检出浓度0.1ng/mL,回收率70%~120%,与AFB2的交叉反应系数小于1%,与AFG1的交叉反应系数为4.65%,与AFG2交叉反应系数小于1%。试剂盒校正曲线的线性范围0.1~1.0ng/mL,试剂盒条内变异<10%,条间变异<15%。

 

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