测定意义: Glu 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,不仅是组成蛋白质的20 种氨基酸之一, 而且通过转氨基作用参与多种氨基酸合成,是生物体内主要氨基来源之一。此外,Glu 还是 味精的主要有效成分,常用做食品添加剂以及香料生物试剂。 测定原理: 利用提取液提取,然后用显色剂进行显色,显色后在570nm 下进行测定。 需自备的仪器和用品: 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、 蒸馏水。 试剂的组成和配制: 试剂一:液体120mL×1 瓶,4℃保存; 试剂二:粉剂×1 瓶, 4℃保存;临用前加入5mL 蒸馏水充分溶解混匀,用不完的试剂仍 4℃ 保存。 谷氨酸提取: 1、细菌或培养细胞样品:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞 数量(104 个):试剂一体积(mL)为500~1000:1 的比例(建议500 万细菌或细胞加入1mL 试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30 次);8000g 常温离心10min,取上清,置冰上待测。 2、组织样品:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组 织,加入1mL 试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 常温离心10min,取上清,置冰上待测。 3、血清(浆)或细胞培养液样品:按照血清(浆)或细胞培养液体积(mL):试剂一体积 (mL)为1:5~10 的比例(建议取0.1mL 血清(浆)或者细胞培养液加入1mL 试剂一),进 行冰浴匀浆。8000g 常温离心10min,取上清,置冰上待测。 测定步骤 1、 分光光度计或酶标仪预热30min 以上,调节波长至570nm,蒸馏水调零。 2、 在有盖EP 管中加入下列试剂: 试剂名称(μL) 测定管 对照管 样本 250 试剂一 250 试剂二 50 50 混匀,90℃水浴20min(盖紧,以防止水分散失),流水冷却,取200uL 至微量石英比色皿 或96 孔板中,于570nm 波长处记录吸光值A。△A=A 测定管-A 对照管。对照管只要做一 管。 注意事项: 为提高检测灵敏度,测定管的吸光值应小于1,若大于1 则需要将上清液用试剂一稀释至适 当倍数后测定,计算公式中乘以相应稀释倍数。 |