羟自由基测定试剂盒说明书

一、测定原理

Fenton反应是zui常见的产生羟自由基的化学反应，H2O2的量和Fenton反应产生的OH.量成正比，当给予电子受体后，

用griess试剂显色，形成红色物质，其呈色与OH.的多少呈正比关系。

二、试剂组成与配制：（50T/48样）

试剂一：3%H2O2标准品储备液0.5ml×1支，4℃保存3个月。0.03%标准品应用液的配制：3%H2O2标准储备液：蒸馏水=1：99稀释，现用现配。

试剂二：底物储备液1ml×1支，4℃保存3个月。

底物应用液的配制:

若您的样本为产生羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度低，则底物应用液的配制：底物储备液：蒸馏水=1：99稀释，现用现配。

若您的样本为产生羟自由基，即测定管吸光度比对照管吸光度高，则底物应用液的配制：底物储备液：蒸馏水=1：299稀释，现用现配。

试剂三：甲液储备液2ml×1支，4℃保存3个月，用时加蒸馏水1：9稀释成应用液。

乙液7ml×2支，4℃保存3个月。

试剂三应用液的配制：甲液应用液与乙液等比例混合，用多少配多少，余下4℃保存。

试剂四：液体10ml×1瓶，用时加蒸馏水稀释至100ml，制备成应用液，4℃保存。若有结晶，则放置37℃水浴至全部溶解后再稀释。

试剂五：液体30ml×1瓶，避光4℃冰箱保存.

试剂六：液体30ml×1瓶，避光4℃冰箱保存.

试剂七：分析纯的冰乙酸（冰醋酸）自备。

显色剂的配制：试剂四应用液：试剂五：试剂六：冰乙酸=8：3：3：2，需多少配多少，现用现配。

注：抑制羟自由基的物质如：血清（浆）、各种组织匀浆液、口服液等；

产生羟自由基的物质如：中性白细胞、某些药物、部分植物等。

三、操作：

以上配制好的应用液，先37℃水浴中预温3分钟，以下操作在37℃水浴中进行。

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混匀，37℃反应1分钟（准确以秒表计时），从加完试剂三开始到一分钟结束，立即加入显色剂终止反应，

一次只能做一只管子。

混匀，室温放置20分钟后，1cm光径，550nm，双蒸水调零，测各管吸光度值。

*：参考取样量：血清(浆)样本用生理盐水20倍稀释后取0.2ml作检测；若您有微量移液器，可直接取0.010ml

血清（浆），再加0.190ml生理盐水。组织匀浆上清，取0.2ml检测。具体取样量需您自己做预试确定，详细预试方法见附录。

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四、计算公式：

1、血清计算公式：

定义：规定每毫升血清（浆）在37℃下反应1 分钟，使反应体系中H2O2 浓度降低1mmol/L

为一个抑制羟自由基能力单位。

抑制羟自由基能力（U/mL）=(对照OD 值-测定OD 值）/（标准OD 值-空白OD 值）×标准品

浓度（8.824mmol/L）×(1mL/取样量) ×样本测试前稀释倍数

2、组织计算公式

定义：规定每毫克组织蛋白在37℃下反应1 分钟，使反应体系中H2O2 浓度降低1mmol/L 为

一个抑制羟自由基能力单位。

抑制羟自由基能力（U/mgprot）=(对照OD 值-测定OD 值）/（标准OD 值-空白OD 值）×标

准品浓度（8.824mmol/L）÷[待测样本蛋白浓度（mgprot/mL）×取样量（0.2mL）]

3、溶血液计算公式：

定义：规定每毫克血红蛋白在37℃下反应1 分钟，使反应体系中H2O2 浓度降低1mmol/L 为

一个抑制羟自由基能力单位。

抑制羟自由基能力（U/mgHb）=(对照OD 值-测定OD 值）/（标准OD 值-空白OD 值）×标准

品浓度（8.824mmol/L）×(1mL/取样量) ×样本测试前稀释倍数÷血红蛋白浓度（mgHb/mL）

4、产生羟自由基能力的计算公式：

定义：规定每毫升或每毫克物质或每立方厘米内106 个细胞在本反应体系中使反应液中H2O2

浓度增加1mmol/L 为一个抑制羟自由基能力单位。

抑制羟自由基能力（U/mL）=(测定OD 值-对照OD 值）/（标准OD 值-空白OD 值）×标准品

浓度（8.824mmol/L）×(1mL/取样量) ×样本测试前稀释倍数

五、注意点：

1.       必须每一支管子单独做，并且反应时间一分钟一定要准确。

2.       必须严格按照操作表顺序加试剂，不可配制混合试剂。

3.       检验样本溶剂或介质可为生理盐水、蒸馏水、醋酸、无水乙醇，但不能为缓冲液。

4.       此法检测灵敏度较高，检测血清（浆）和组织以外样本时，先取原液及不同浓度稀释后的样本，

例如5倍稀释液或10倍稀释液做预试。如测定管颜色太浅可将样本用其溶剂继续稀释至颜色深为止。

我所曾检测花粉的水提液的活性氧，将其原液稀释150倍后，显色较好。

附录

羟自由基佳取样浓度及佳取样量摸索方法

一、样本处理

1.    血清（浆）：用生理盐水将血清（浆）按1：1、1：4、1：9、1：19等稀释成一系列不同浓度的血清（浆），

分别取不同浓度的血清（浆）0.2ml按血清（浆）的测定操作表进行检测。

2.    组织匀浆、细胞、线粒体或细胞膜等组织：分别用生理盐水将组织匀浆稀释成10%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%

等一系列不同浓度的组织匀浆，分别取不同浓度的组织匀浆0.2ml按组织的测定操作表进行检测。

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二、操作步骤：

血清（浆）佳取样浓度及佳取样量的摸索举例：

1.    样本来源：正常组大鼠眼眶取全血，肝素抗凝取血浆测活性氧为例

2.    样本稀释：用生理盐水将血浆按1：1、1：4、1：9、1：19、1：49、1：99稀释成一系列不同浓度的血浆，

分别取不同浓度的血浆0.2ml按血清（浆）的测定操作表进行检测。

3.    操作表       

   混匀，37℃反应1分钟（准确以秒表计时），从加完试剂三开始到一分钟结束，立即加入显色剂终止反应，

一次只能做一支管子。

混匀，室温放置20分钟，1cm光径，550nm，蒸馏水调零，测各管吸光度值。

4.   预试结果

5.  结论：

从上面的数据统计可以看出，抑制率（抑制率=（对照管OD-测定管OD）/对照管OD×在45%-55%之间

的zui取样浓度为1：19.即1：19稀释正常组大鼠血浆0.2ml进行羟自由基正式检测。

三、讨论

在您进行正式检测前，需要从每组中取2-3个样本进行上面的预试实验，确定佳浓度和佳取样量。在保证

抑制率【抑制率=（对照OD值-测定OD值）÷对照OD值×）】在20%-50%之间的同时，每组之间应该有所差异，如有疑问，则需要重新摸索佳浓度和佳取样量。

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