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羟自由基测定试剂盒到货了,欢迎联系
发布时间:2017-12-19   点击次数:990次

羟自由基测定试剂盒到货了,欢迎

 

羟自由基测定试剂盒说明书

一、测定原理

Fenton反应是zui常见的产生羟自由基的化学反应,H2O2的量和Fenton反应产生的OH.量成正比,当给予电子受体后,

用griess试剂显色,形成红色物质,其呈色与OH.的多少呈正比关系。

二、试剂组成与配制:(50T/48样)

试剂一:3%H2O2标准品储备液0.5ml×1支,4℃保存3个月。0.03%标准品应用液的配制:3%H2O2标准储备液:蒸馏水=1:99稀释,现用现配。

试剂二:底物储备液1ml×1支,4℃保存3个月。

底物应用液的配制:

若您的样本为产生羟自由基,即测定管吸光度比对照管吸光度低,则底物应用液的配制:底物储备液:蒸馏水=1:99稀释,现用现配。

若您的样本为产生羟自由基,即测定管吸光度比对照管吸光度高,则底物应用液的配制:底物储备液:蒸馏水=1:299稀释,现用现配。

试剂三:甲液储备液2ml×1支,4℃保存3个月,用时加蒸馏水1:9稀释成应用液。

乙液7ml×2支,4℃保存3个月。

试剂三应用液的配制:甲液应用液与乙液等比例混合,用多少配多少,余下4℃保存。

试剂四:液体10ml×1瓶,用时加蒸馏水稀释至100ml,制备成应用液,4℃保存。若有结晶,则放置37℃水浴至全部溶解后再稀释。

试剂五:液体30ml×1瓶,避光4℃冰箱保存.

试剂六:液体30ml×1瓶,避光4℃冰箱保存.

试剂七:分析纯的冰乙酸(冰醋酸)自备。

显色剂的配制:试剂四应用液:试剂五:试剂六:冰乙酸=8:3:3:2,需多少配多少,现用现配。

注:抑制羟自由基的物质如:血清(浆)、各种组织匀浆液、口服液等;

产生羟自由基的物质如:中性白细胞、某些药物、部分植物等。

三、操作:

以上配制好的应用液,先37℃水浴中预温3分钟,以下操作在37℃水浴中进行。

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标准空白管

标准管

对照管

测定管

蒸馏水ml

0.4

0.2

0.2

 

0.03%H2O2标准应用液ml

 

0.2

 

 

底物应用液ml

 

 

0.2

0.2

样本*ml

 

 

 

0.2

试剂三应用液ml

0.4

0.4

0.4

0.4

混匀,37℃反应1分钟(准确以秒表计时),从加完试剂三开始到一分钟结束,立即加入显色剂终止反应,

一次只能做一只管子。

显色剂ml

2

2

2

2

混匀,室温放置20分钟后,1cm光径,550nm,双蒸水调零,测各管吸光度值。

*:参考取样量:血清(浆)样本用生理盐水20倍稀释后取0.2ml作检测;若您有微量移液器,可直接取0.010ml

血清(浆),再加0.190ml生理盐水。组织匀浆上清,取0.2ml检测。具体取样量需您自己做预试确定,详细预试方法见附录。

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四、计算公式:

1、血清计算公式:

定义:规定每毫升血清(浆)在37℃下反应1 分钟,使反应体系中H2O2 浓度降低1mmol/L

为一个抑制羟自由基能力单位。

抑制羟自由基能力(U/mL)=(对照OD 值-测定OD 值)/(标准OD 值-空白OD 值)×标准品

浓度(8.824mmol/L)×(1mL/取样量) ×样本测试前稀释倍数

2、组织计算公式

定义:规定每毫克组织蛋白在37℃下反应1 分钟,使反应体系中H2O2 浓度降低1mmol/L 为

一个抑制羟自由基能力单位。

抑制羟自由基能力(U/mgprot)=(对照OD 值-测定OD 值)/(标准OD 值-空白OD 值)×标

准品浓度(8.824mmol/L)÷[待测样本蛋白浓度(mgprot/mL)×取样量(0.2mL)]

3、溶血液计算公式:

定义:规定每毫克血红蛋白在37℃下反应1 分钟,使反应体系中H2O2 浓度降低1mmol/L 为

一个抑制羟自由基能力单位。

抑制羟自由基能力(U/mgHb)=(对照OD 值-测定OD 值)/(标准OD 值-空白OD 值)×标准

品浓度(8.824mmol/L)×(1mL/取样量) ×样本测试前稀释倍数÷血红蛋白浓度(mgHb/mL)

4、产生羟自由基能力的计算公式:

定义:规定每毫升或每毫克物质或每立方厘米内106 个细胞在本反应体系中使反应液中H2O2

浓度增加1mmol/L 为一个抑制羟自由基能力单位。

抑制羟自由基能力(U/mL)=(测定OD 值-对照OD 值)/(标准OD 值-空白OD 值)×标准品

浓度(8.824mmol/L)×(1mL/取样量) ×样本测试前稀释倍数

五、注意点:

1.       必须每一支管子单独做,并且反应时间一分钟一定要准确。

2.       必须严格按照操作表顺序加试剂,不可配制混合试剂。

3.       检验样本溶剂或介质可为生理盐水、蒸馏水、醋酸、无水乙醇,但不能为缓冲液。

4.       此法检测灵敏度较高,检测血清(浆)和组织以外样本时,先取原液及不同浓度稀释后的样本,

例如5倍稀释液或10倍稀释液做预试。如测定管颜色太浅可将样本用其溶剂继续稀释至颜色深为止。

我所曾检测花粉的水提液的活性氧,将其原液稀释150倍后,显色较好。

附录

羟自由基佳取样浓度及佳取样量摸索方法

一、样本处理

1.    血清(浆):用生理盐水将血清(浆)按1:1、1:4、1:9、1:19等稀释成一系列不同浓度的血清(浆),

分别取不同浓度的血清(浆)0.2ml按血清(浆)的测定操作表进行检测。

2.    组织匀浆、细胞、线粒体或细胞膜等组织:分别用生理盐水将组织匀浆稀释成10%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%

等一系列不同浓度的组织匀浆,分别取不同浓度的组织匀浆0.2ml按组织的测定操作表进行检测。

 

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二、操作步骤:

血清(浆)佳取样浓度及佳取样量的摸索举例:

1.    样本来源:正常组大鼠眼眶取全血,肝素抗凝取血浆测活性氧为例

2.    样本稀释:用生理盐水将血浆按1:1、1:4、1:9、1:19、1:49、1:99稀释成一系列不同浓度的血浆,

分别取不同浓度的血浆0.2ml按血清(浆)的测定操作表进行检测。

3.    操作表       

 

空白管

标准管

对照管

测定管

双蒸水ml

0.4

0.2

0.2

 

0.03%H2O2标准应用液ml

 

0.2

 

 

试剂二(底物应用液)ml

 

 

0.2

0.2

样本ml

 

 

 

 0.2

 

试剂三ml

0.4

0.4

0.4

0.4

   混匀,37℃反应1分钟(准确以秒表计时),从加完试剂三开始到一分钟结束,立即加入显色剂终止反应,

一次只能做一支管子。

显色剂ml

2

2

2

2

混匀,室温放置20分钟,1cm光径,550nm,蒸馏水调零,测各管吸光度值。

4.   预试结果

对照

0.785

 

空白

0.003

标准

0.443

稀释倍数

1:1

1:4

1:9

1:19

1:49

1:99

吸光度值

0.105

0.132

0.188

0.408

0.677

0.741

抑制率

86.59%

83.16%

76.01%

47.99%

13.71%

5.66%

5.  结论:

从上面的数据统计可以看出,抑制率(抑制率=(对照管OD-测定管OD)/对照管OD×在45%-55%之间

的zui取样浓度为1:19.即1:19稀释正常组大鼠血浆0.2ml进行羟自由基正式检测。

三、讨论

在您进行正式检测前,需要从每组中取2-3个样本进行上面的预试实验,确定佳浓度和佳取样量。在保证

抑制率【抑制率=(对照OD值-测定OD值)÷对照OD值×)】在20%-50%之间的同时,每组之间应该有所差异,如有疑问,则需要重新摸索佳浓度和佳取样量。

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