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组织甘油三酯检测试剂盒操作方法详解!
发布时间:2018-09-28   点击次数:1014次

组织甘油三酯检测试剂盒操作方法详解!

 

描述:

甘油三酯是由甘油和脂肪酸酯化而成,是血脂的主要成分,也是机体重要的供能物质。高甘油三酯和高胆固醇血症是常见的高脂血症,与许多疾病相关。与血浆甘油三酯测定相比,实体组织和细胞的甘油三酯测定并非易事。本试剂盒避免了有毒的lv仿甲醇提取、繁杂的氮气吹干和脂质复溶等步骤,采用能试剂进行组织细胞裂解和甘油三酯抽提,而且优化了GPO Trinder酶学反应组分和操作步骤。简单易行、灵敏度高检测范围为 20-2000µmol/L。可用于测量动植物组织细胞、固态食品材料、高浓度油料样品中的甘油三酯含量。

 

原理:

(1)脂肪酶分解血清中的甘油三酯为甘油;(2)甘油激酶将甘油化为3-甘油;(3)3-甘油被甘油氧化酶氧化产生过氧化氢;在过氧化物酶作用下生色底物转化为苯醌亚胺,其光密度值与甘油浓度成正比。

适用范围:适用于动物实体组织、培养细胞、油料植物组织、固态食品组织、高浓度油料样品中甘油三酯含量的测定。

 

操作方法:

组织细胞裂解:
   在裂解前,组织或者细胞用PBS洗涤两次以去除甘油
1. 原代脂肪细胞:200g,5分钟离心收集细胞。建议每100 µl压积(Packed Cell Volume)脂肪细胞加入1ml裂解液,震荡裂解,而后室温静置10分钟。
2. 分化脂肪细胞或非脂肪细胞:可先用胰酶消化、离心收集细胞而后进行裂解,也可直接在培养皿内进行裂解。通常情况下,可按比例每1x106 个细胞加入0.1ml裂解液,混匀后室温静置10分钟。
3. 动物组织:离心管称重,加入组织块后再称重,二者相减(即减量称重法)计算组织重量(约50mg)。强烈建议按比例每1mg组织加20µl裂解液以减少样品间蛋白和脂质含量变异而产生的误差。强烈建议裂解液用量在1ml左右,保证有效的匀浆裂解与脂质提取。用电动高速匀浆器或手动玻璃匀浆器破碎组织。(不推荐超声方法,因其不能完全和均匀破碎。应根据预实验调整初始的组织细胞加入量),匀浆后静置10分钟。
4. 植物油料种子、食品、含高油量样品:用减量称重法对样品进行称重,建议按比例每1mg组织加20µl裂解液以减少样品间蛋白和脂质含量变异而产生的误差。加入裂解液后可用研钵对样品进行研磨,而后将研磨液转移到新的离心管中,室温静置10分钟。

 

组织甘油三酯检测试剂盒操作方法详解!

二. 裂解液处理:
1. 取适量上清液转移到1.5ml离心管中,进行步骤2的操作。余下的裂解液可用BCA法蛋白定量试剂盒(#P1511)进行蛋白定量或-20ºC储存。
2. 70ºC 加热10分钟,组织量多时可能出现絮状沉淀。
3. 室温2000rpm离心5分钟,上层清液即可用于酶学测定。

二 工作溶液配制:按4:1比例,取4ml试剂R1与1ml试剂R2混合即可,立即使用或4ºC保存<1天,变色弃去。

三 标准品稀释:用蒸馏水、生理盐水或与样品缓冲液一致的液体,将4mM甘油标准品倍比稀释为1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L,通常取其中4~6管即可,注意设置0浓度对照反应管。

 

注意事项:

1.  维生素C>0.18g/L、血红蛋白>2g/L、胆红素>0.25g/L、强还原剂二硫苏糖醇、巯基乙醇等会干扰测。高浓度EDTA会干扰测定。

2.  样本即使保存在-20ºC的环境下,甘油三酯也会自发水解。因此建议样品4ºC保存时间应短于24小时,当-70ºC保存时,也应不超过1个月。

3.  如果室温较低,应延长反应时间或在37ºC进行反应。

4.  不同类型组织和细胞内甘油三酯含量差别很大,应根据预实验调整初始的裂解液的加入量。对于脂肪组织而言,一般来说裂解液用量在20-30mg/ml即可。

 

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