细胞培养的环境及条件有哪些？

细胞冻存方法、步骤及注意事项！

一、保存方法（主要有两个）：

（1）传统方法：冷存管置于410分钟→ -2030分钟→ -8016～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase储存。-20不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

（2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3/分钟之速度由室温降至（-80以下）-120，再放在液氮槽vaporphase储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

二、步骤：

（1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。

（2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，*后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。

（3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。

（4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示*之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。

三、注意事项：

（1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。细胞冻存前应保证细胞的活力好，无污染

（2）冷冻前检测细胞是否仍保有其*性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

（3）一定要保证DMSO的浓度是10%，冻细胞要舍得用进口的DMSO

（4）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽**后避光保存。在开启后一年内使用，因储存后对细胞会有毒性。

（5）慢冻,快解冻。细胞在 -15 度左右胞内形成结晶对细胞损伤，缓慢降温有助于减少损伤，故放入 -20 度冰箱中冻存可实现缓慢降温较为方便，保存时间过久会影响细胞活力。

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细胞培养的环境及条件有哪些？