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南京信帆-Western blot实验代测注意这几点很关键!
发布时间:2020-01-17   点击次数:327次

南京信帆-Western blot实验代测注意这几点很关键!

 

通过电泳区分不同的蛋白组分,并转移至固相支持物(膜),通过特异性试剂(抗体)作为探针,对靶物质进行检测。可检测到低至1~5ng(zui低可到10~100pg)中等大小的靶蛋白。

 

 

蛋白样品制备的注意事项:

1、细胞数量达5×106

2、将细胞裂解液再离心,收集上清液,加loading煮样5min。

 

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项:

1、做胶:防止漏胶、进气泡以及花胶(水封、插梳子和拔梳子)

2、加样:两边加loading,加样量一样,加样时间要尽量短,以免样品扩散。

3、电泳:将胶夹好放于电泳槽中,加电泳buffer(内外面不能联通),将电压调到90V开始电泳。


转膜注意事项:

1、泡膜:转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移buffer浸泡20min。(1.凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡,就会在转膜过程中出现凝胶皱缩,导致出现转移条带变形。2.PVDF膜具有疏水性,需用甲醇浸泡)

2、转膜顺序:阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板

3、转膜条件:0.3 250V 1h40min 冰浴中进行转膜(具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定;目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,反之则短)

4、避免直接用手碰杂交膜,使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。

5、夹好膜和凝胶后,确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在,否则会导致转膜不完全。

6、保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样,过大和过小都会影响转膜效率。

7、鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力,从而产生较高的背景,故如果选择鸡来源的抗体使用硝酸纤维素膜(NC膜)

关于磷酸化蛋白检测的注意事项:

1、保持待测蛋白处于磷酸化状态!在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂(NaF,可以防止去磷酸化),并将标本时刻保持在冰浴中!

2、使用5%的BSA作为封闭试剂!不能使用脱脂奶粉!(因为脱脂奶粉中含有酪蛋白,会出现很高的背景)。


抗体保存注意事项:

1、收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装盒保存!

2、对于大部分抗体,比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃

  2.1 分装的量以一次实验用完为好,zui少不能少于10μl每份。因为分装体积越小,抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。

  2.2 复融后的分装抗体如果一次用不完,将剩余母液保存在4℃,避免再冻起来!

  2.3 避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。

3、大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。

4、保存,加入叠氮钠,防止细菌污染。

 

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