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镍-琼脂糖凝胶FF(Ni-Berpharose FF)
发布时间:2020-11-25   点击次数:225次

镍-琼脂糖凝胶FF(Ni-Berpharose FF)

 

1.      产品介绍

镍-琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质,活化偶联亚氨基二乙酸(IDA),之后螯合Ni2+。IDA是金属螯合层析中常用的配体,和次氮基三乙酸(NTA)相比,IDA具有亲和力强、载量高、可再生重复使用等优点。

镍-琼脂糖凝胶FF主要用于纯化含有组氨酸标签(His-Tag)的重组蛋白。组氨酸标签中的咪唑环同过渡金属Ni2+形成稳定的配位键,能特异、牢固和可逆地吸附在固定有Ni2+的基质上,可通过增加咪唑浓度对重组蛋白进行竞争洗脱。

2.规格

1ml(预装柱)、5ml(预装柱)、10ml(预装柱)、20ml、100ml、500ml

4.纯化流程

①平衡

镍-琼脂糖凝胶FF柱用2~5个柱体积的初始缓冲溶液进行平衡。

建议流速为100 cm/h。

②上样

(1)样品一般溶解于pH6~8的初始缓冲液中。提高上样缓冲液的pH值可以增大载量。

(2)缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐,同时避免巯基乙醇、DTT等还原剂。

(3)常用缓冲液有10~100 mM磷酸钠缓冲液、20~200 mM Tris-HCl缓冲液等。

(4)缓冲液中一般要加入0.15~0.5 M的NaCl以消除离子交换作用。

(5)初次使用镍-琼脂糖凝胶FF时,推荐使用50 mM PBS(50 mM NaH2PO4,0.5 M NaCl,pH 7.4)作为初始缓冲液。

③洗脱

(1)增加咪唑浓度进行洗脱是镍-琼脂糖凝胶FF常用的洗脱方法。

(2)咪唑为碱性,相应缓冲液配制后需要用HCl调节pH值。

(3)初次使用镍-琼脂糖凝胶FF时,如不确定洗脱需要的咪唑浓度,推荐在初始缓冲液中分别加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑,浓度从低

到高分别洗脱和收集重组蛋白,之后通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定洗脱结果。

(4)有条件的可以进行咪唑梯度线性洗脱以确定较佳的洗脱条件。

 

洗脱方法

(1)降低pH洗脱:大多数蛋白在pH6~4会被洗脱下来(也可以在pH 3~4),缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸和磷酸盐缓冲体系。

(2)竞争性洗脱:线性增加或一步增加同金属离子有亲和力的竞争物质的浓度(如0~0.5M咪唑、0~50 mM组氨酸、0~2M NH4Cl)。梯度洗脱在起始缓冲液的恒定pH值下进行。

(3)螯合剂洗脱:EDTA、EGTA等螯合剂可同金属离子产生作用力,导致蛋白被洗脱下来。此法不能分离不同的蛋白,还会影响蛋白的吸附,导致融合蛋白无法挂柱。

注:降低pH洗脱和螯合剂洗脱会使得金属离子脱落,下次使用前需要重新螯和金属离子。常用的方法为竞争性洗脱。

上述洗脱方法,均须在缓冲液中加入150 ~500mM的NaCl以消除离子交换作用。

 

5.再生、清洗、保存

①凝胶再生

(1)多次使用后或需要更换螯合的金属离子时,必须将凝胶脱镍再生。脱镍方法:用5~10个柱体积的蒸馏水淋洗柱子,再用5~10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子,用2~3个柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。

(2)多次使用的柱子脱镍后一般需要进行清洗。清洗方法:用0.1~1.0 M NaOH反向清洗柱子,50 cm/h保持1~2 h,能去除结合强的杂质,同时也能去除热源。

(3)清洗后需要重新螯合金属离子。螯合方法:用2~5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍后的柱子,用0.1~0.3 M金属盐溶液过柱5~10个柱体积以螯合金属离子,之后用5~10个柱体积的蒸馏水淋洗以去除未螯合的金属离子。

②在位清洗

(1)去除因离子交换作用吸附的蛋白:2~3个柱体积的2 M NaCl溶液反向清洗。

(2)去除强疏水性蛋白和脂质等:4个柱体积的70%乙醇或者30%异丙醇反向清洗。

(3)除去蛋白沉淀、疏水性蛋白:参照凝胶再生步骤。

 

6.注意事项:

1)使用时保证柱子和缓冲液的温度一致,避免柱床内产生气泡,影响纯化效果。

2)本产品保存条件为20%乙醇,4~8℃。

3) 2-25℃,常压,避光运输

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