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Western Blot实验过程中常遇到的问题
发布时间:2020-12-23   点击次数:181次

Western Blot实验过程中常遇到的问题

 

Western 免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

WB 实验中常会出现各种问题,迪申生物技术(上海)有限公司专注于生产免疫组化相关产品多年,对 WB 实验有一定了解,今天跟各位同学一起分享下 WB 实验中各种问题及应用对策。

 

电泳条带成笑脸状 胶不均匀冷切,中间冷却不好,电泳系统温度偏高 减少电压减慢电泳速度,在冷室或者冰浴中进行电泳

电泳条带成皱眉状 可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全 调整装置

拖尾 样品溶解不好 样品充分溶解混匀后上样

纹理(纵向条纹) 样品中含有不溶性颗粒 样品充分搅拌混匀

条带偏斜 电极不平衡或者加样位置偏斜 调整电极和加样

条带两边扩散 加样量过多 适当减少上样量

Marker 变黑色 抗体和 Marker 蛋白反应 在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样

背景高 膜封闭不够 延长封闭时间,选择适宜的抗体稀释度

一抗稀释度不适宜 对抗体进行滴度测试,选择适宜的抗体稀释度

一抗孵育的温度偏高 建议 4℃ 结合过夜

二抗浓度度过高 降低二抗浓度

二抗的非特异性背景 增加一个二抗对照,不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗(特异性更强的,只针对重链)

二抗孵育时间过久 减少二抗孵育时间

选择膜的问题 硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低

膜在实验过程中干过 实验过程中要注意保持膜的湿润

检测时曝光时间过长 注意曝光时间的缩短

洗膜不充分 增加洗膜的时间和次数

抗体和封闭蛋白有交叉反应 检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性,选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应

杂带较多 目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点,糖基化位点,乙酰化位点等),本身可以呈现多条带 查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白试剂大小

目的蛋白有其他剪切本 查阅文献或生物信息学分析可能性

样品处理过程中目的蛋白发生降解 裂解液中加入蛋白酶抑制剂,样品处理在冰上进行

上样量过高,太敏感 适当减少上样量

一抗不纯 纯化抗体

一抗特异性不高 重新选择或制备高特异性的抗体

二抗的非特异性结合 增加一个二抗对照,不加一抗,其他操作过程不变,即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗(特异性更强的,只针对重链)

一抗或二抗浓度偏高 降低抗体浓度

细胞传代较多,导致蛋白变异 使用原代或传代少的细胞作对照

蛋白条带位置

(大小)不对 二聚体或多聚体存在 增加蛋白质变性过程及强度

翻译后剪切 比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的,在执行功能时需要进行剪切成活化的形式

相对电荷 氨基酸电荷的组成

蛋白修饰 比如糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加

胶浓度 不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差

无蛋白条带 抗体孵育不充分 增加抗体浓度,延长孵育时间

酶失活 直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物

标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低 设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因

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