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总RNA提取试剂盒操作详情
发布时间:2021-05-13   点击次数:207次

总RNA提取试剂盒操作详情

 

核糖核酸(缩写为RNA,即Ribonucleic Acid),存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由,核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种,即A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、U(),其中,U()取代了DNA中的T。核糖核酸在体内的作用主要是引导蛋白质的合成

 

人体一个细胞含RNA约10pg(含DNA约7pg)。与DNA相比,RNA种类繁多,分子量较小,含量变化大。RNA可根据结构和功能的不同分为信使RNA和非编码RNA。非编码RNA分为非编码大RNA和非编码小RNA。非编码大RNA包括核糖体RNA、长链非编码RNA。非编码小RNA包括转移RNA、核酶、小分子RNA等。小分子RNA(20~300nt)包括 miRNA、 SiRNA、 piRNA、scRNA、 snRNA、 snoRNA等,细菌也有小分子RNA(50~500nt)

 

操作步骤:

1. 样品处理: a. 植物组织:取新鲜或-70℃冻存100mg组织在液氮中研磨,把粉末加入到1ml裂解液中混匀。
b. 动物组织:取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液,用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。
c. 贴壁细胞:直接在培养板中加入裂解液裂解细胞,每106细胞加1ml 裂解液。用取样器吹打混匀。
d. 细胞悬液:离心收集细胞。每106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml裂解液混匀。
e. 血液处理:取0.2-1ml新鲜血液加3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10分钟,10000rpm离心1分钟。弃上清,若沉淀含有红细胞,可加入2倍体积红细胞裂解液重复裂解步骤。离心后沉淀加入1 ml裂解液混匀。
2. 将处理后的样品在室温放置5分钟,使得核酸蛋白复合物完全分离。
3. 向匀浆样品中加0.2ml,盖好管盖,剧烈振荡15秒,室温放置3-5分钟。
4. 2-8℃ 12000 rpm离心10分钟。RNA主要在上层无色的水相中,把水相转移到新管中,不要吸到沉淀。
5. 吸附柱前处理:在吸附柱中加入500ul 洗柱液,室温放置2分钟,2-8℃ 12,000 rpm离心2min,弃废液。
6. 第4步收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀,加入吸附柱静置2分钟,2-8℃ 12000rpm离心2min,弃废液。
7. 向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇),2-8℃ 12,000 rpm离心2min,弃废液。
8. 向吸附柱中加入600ul漂洗液,2-8℃ 12,000 rpm离心2min,弃废液。
9. 12000rpm离心2min,弃掉收集管,将吸附柱置于室温放置数分钟将吸附柱中残余的漂洗液去除。
10. 将吸附柱放入新管中,向膜滴加50-100ul RNase free ddH2O,室温放置5min,12000rpm室温离心2min即得到RNA。

注意事项:
1,所有相关器皿耗材都应为RNase-free产品,操作过程要小心、手套避免环境中RNA酶污染样品。
2,RNA在水溶液中OD值可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯,需电泳检测。

 

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