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Annexin V-FITCPI凋亡检测试剂盒操作注意以下几点
发布时间:2022-05-23   点击次数:89次

Annexin V-FITCPI凋亡检测试剂盒操作注意以下几点


 细胞凋亡是细胞的基本特征之一,在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面都起到十分重要的作用。Annexin V 是一种分子量为35.8 KD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的磷脂酰丝氨-酸(Phosphatidylserine, PS)高亲和力特异结合。FITC-Annexin V 结合到凋亡细胞后,在蓝色光的激发下,发出绿色荧光,区分出凋亡细胞与正常细胞。碘化丙啶(Propidium iodide,PI)是一种核酸染料,它不能穿透完整细胞膜,但对凋亡晚期细胞和死细胞的破损细胞膜能够穿透,并使细胞核红染。将FITC-Annexin V 与PI 匹配使用,可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞区分开来。

细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨-酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。AnnexinV具有易于结合到磷脂类如PS的特性,对PS有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所*的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以采用AnnexinV与PI双染的方法,通过流式检测细胞早期凋亡。


注意事项:

1. 微量试剂需离⼼数秒将试剂收集⾄管底后再开盖取⽤。

2. Propidium Iodide(PI)、Annexin V-FITC有毒,操作时要带⼿套,使⽤时避免与⽪肤,眼睛和黏膜接触。

3. 本试剂盒⽤于检测活细胞,流式细胞仪检测时,细胞数量不应低于1x106。

4. 染⾊后宜尽快检测,时间过⻓可能会导致凋亡或坏死细胞的数量增加。

5. Annixin V检测凋亡细胞的⽅法适⽤于悬浮⽣⻓的细胞,如:淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁⽣⻓的细胞,由于在胰-酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤,会造成较⾼的假阳性,而用细胞刮子会造成细胞粘连成团,从而影响检测,可将胰-酶消化后的细胞保存在含2%BSA的PBS中,防⽌进⼀步的损伤。尽管⽬前,包括国外也有⼀些单位采⽤该⽅法检测贴壁⽣⻓的细胞。但不推荐,因为其重复性较差,且需要操作时⾮常⼩⼼。

6. .细胞固定后可能导致荧光的淬灭,请不要固定样品。

7. .如果样品来源于血液,请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS,能与Annexin V结合,从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200g离心洗去血小板。



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