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Western及IP细胞裂解液使用操作指南
更新时间:2023-08-10   点击次数:355次

 Western及IP细胞裂解液使用操作指南

 

Western及IP细胞裂解液是采用一种非变性裂解方法来裂解细胞,并获得总蛋白的裂解液。所获得的蛋白质可以用于PAGE电泳,Western,免疫沉淀(Immunol Precipitation,IP)和免疫共沉淀(co-IP)等,主要由Tris-HCl、NaCl、低浓度Triton X-100, 低浓度sodium pyrophosphate等组成,并含有多种蛋白酶抑制剂成分,可以有效抑制蛋白的降解,并维持原有的蛋白间相互作用。

 

操作说明:(仅供参考)

对于培养细胞样品:

1. 融解Western及IP细胞裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。

2. 对于贴壁细胞:去除营养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰,可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后,细胞就会被裂解。 对于悬浮细胞:离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必须分装成50-100万细胞/管,然后在裂解。大团的细胞较难裂解充分,而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触,相对比较容易裂解充分。

3. 充分裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。

4. 裂解液使用量说明:通常6孔板每孔细胞加入100μL裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150μL或200μL。每100万细胞用100μL本产品裂解后获得的上清,其蛋白浓度约为2-4mg/ml,不同细胞有所不同。

 

对于组织样品:

1. 把组织剪切成细小的碎片。

2. 融解Western及IP细胞裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。

3. 按照每20mg组织加入100-200μL裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。)

4. 用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。

5. 充分裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200微升本裂解液裂解后获得上清,其蛋白浓度约为15-25mg/ml,不同状态的不同组织有所不同。

6. 如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈vortex是样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续试验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

注意事项

1.为取得最佳的使用效果,尽量避免过多的反复冻融。可以适当分装后使用。

2.裂解样品的所有步骤都需要在冰上或4℃进行。

3.本产品仅供科研实验用,不做其它用途。

4.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

 


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