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信帆生物针对WB常见问题在线解答
发布时间:2020-08-07   点击次数:242次

信帆生物针对WB常见问题在线解答


蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )是很常规的生物学实验,是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

1、为什么我的细胞提取液中没有检测到目的蛋白?

答:可能的原因有:

1)细胞中不表达这种蛋白质,换一种细胞;

2)抗体不能识别目标蛋白,多看看说明,是否有问题;

3)可能是没有保持低温操作,样品保存不当,样品放置时间过长;

4)细胞中的蛋白质被酶降解掉了,可加入蛋白酶抑制剂,抑制蛋白酶活性。

2、我的目的带很弱,如何加强?

答:1)可以加大抗原上样量,这是主要的;

2)也可以将一抗稀释比例降低;

3)还可以延长曝光时间。

3、我做的蛋白质分子量很小(10KD),请问怎么做WB?

答:1)可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜,转膜时间缩短,另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系;

2)也可以选择PSQ 膜,同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起,再转移。其他按步骤即可。

4、大分子量蛋白200KD,在做WB要注意什么?

答:1)做200kd蛋白的WB时要注意,分离胶选择>7%的;剥胶时要小心;

2)转移时间需要相应延长;要做分子量参照(否则出现杂带不知道如何分析);

3)转膜液甲醇含量可适当降低,推荐使用湿装转膜效率更高哦!

5、如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量?

答:可以浓缩样品,也可以根据目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超载30%是不会有问题的。如果已经超了不少了,而且小分子量的也要,可以考虑加大胶的厚度,可以试试1.5mm的。

6、WB中抗体的可以重复应用吗?

答:抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。稀释后应在2-3天内使用,4度保存,避免反复冻融。

7、上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到佳效果?

答:无特殊要求。但一般是上槽放新鲜的缓冲液,下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。

8、免疫组化和WB可以用同一种抗体吗?

答:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇(又称表位),有些表位是线性的,而有的属于构象型;线性表位不受蛋白变性的影响,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。如果所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸,也就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化和WB,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。

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