影响Taq DNA聚合酶的四大因素

Taq DNA聚合酶是第yi个被发现的热稳定DNA聚合酶，分子量65kD，开始由Saiki等从温泉中分离的一株水生噬热杆菌（thermus aquaticus）中提取获得。此酶能耐高温，在70℃反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%；在分子克隆中Taq DNA聚合酶可用于DNA序列测定并可利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）对DNA的特定片段进行体外扩增。在PCR过程中，由于Taq DNA聚合酶在变性步骤中（约94℃）不失活，可直接进入第二轮循环，因此不必每轮循环时重新加入新酶，这使得Taq DNA聚合酶成为PCR反应中的*用酶。

（一）温度：虽然Taq DNA聚合酶有很强的温度适应范围，但高于60℃的环境仍会使部分酶变性失活。反之，如果温度低于正常值，酶活性受到限制。而且由于引物在低温下（特别是25—27℃）可能与基因组中别的部分同源序列结合，使得一些扩增产物并非为目的序列。适当提高温度，错配碱基多会解离，反应产物特异性增加。
（二）镁离子浓度：Taq DNA聚合酶活性对Mg2+的浓度非常敏感。Taq DNA聚合酶和许多其他聚合酶一样，是Mg2+依赖性酶。用鲑鱼精DNA作模板，dNTP的总浓度为0.9~0.8mmol/L，用含不同浓泼MgCl2的PCR系统使反应进行10分钟。测定结果表明：在MgCl2为2.0mmol/L条件下，酶活性显示盈高。Mg2+浓度偏高，酶活性会受到限制，10mmol/LMgCl2使酶活性抑制约50%。由于Mg2+可以与负离子或负离子团（如根）结合，而在PCR中，DNA模板、引物以及dNTP是根的主要来源，其中dNTP占有很大比例。因此反应系统中，Mg2+的浓度还要受到dNTP浓度的影响，欲获得反应结果，要对反应条件进行必要的探索。每当一个新的目的片段和引物第yi次使用时，或者某种参数（dNTP或引物浓度）改变时，应进行Mg2+的浓度滴定。一个普遍的原则是，样品中Mg2+的浓度至少要比dNTP总浓度高0.5~1.0mmol/L。
（三）KCl的浓度：一般是50mmol/L，高于75mmol/L时，聚链反应就受到明显的限制。当KCl浓度高达200mmol/L以上时，聚链反应就受到明显的限制，此时反应进行10分钟仍无核苷掺入．浓度均为50mmol/L的NH4ClNH4Ac以及NaCl对TaqDNA聚合酶活性影响则分别为中等抑制、无影响以及25~30%促进。
（四）dNTP的浓度：均衡的低浓度dNTP更有利于酶活性的发挥，并能减少错配，获得多量的特异性强的DNA反应产物。各种核苷酸浓度为40umol/L的100ulPCR系统可以得到2.6ugDNA产物，而只消耗所提供核苷酸的半量；
（五）几种变性剂对酶活性的影响：10%乙醇尚不抑制酶活性；二甲基亚砜（DMSO），二甲替甲酰胺（DMF）。甲酰胺在低浓度时对酶活性无影响，随着它们浓度的提高，酶活性明显下降。l0%DMSO会使酶活性减半。然而另有研究者观察到，在某些聚链反应系统中，10%DMSO起着有利作用。这种结构各异的现象还表现在用尿素进行的实验中。1.0mol/L尿素能提高酶活性，2.0mol/L尿素能保存大部分酶活性。然而也有报告认为0.5mol/L尿素则*抑制PCR。总之，变性剂对TaqDNA聚合酶以及PCR系统的影响参数有待更多的实验数据。TaqDNA聚合酶对SDS十分敏感，而某些非离子型去污剂又能*消除低浓度SDS对酶活性的抑制效应。例如，0.5%Twen20及0.5%NP40可抵销0.01%SDS对酶活性的影响。