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影响Taq DNA聚合酶的四大因素
发布时间:2020-08-12   点击次数:4144次

影响Taq DNA聚合酶的四大因素

 

Taq DNA聚合酶是第yi个被发现的热稳定DNA聚合酶,分子量65kD,开始由Saiki等从温泉中分离的一株水生噬热杆菌(thermus aquaticus)中提取获得。此酶能耐高温,在70℃反应2h后其残留活性大于原来的90%,在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%,在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%;在分子克隆中Taq DNA聚合酶可用于DNA序列测定并可利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)对DNA的特定片段进行体外扩增。在PCR过程中,由于Taq DNA聚合酶在变性步骤中(约94℃)不失活,可直接进入第二轮循环,因此不必每轮循环时重新加入新酶,这使得Taq DNA聚合酶成为PCR反应中的*用酶。

 

(一)温度:虽然Taq DNA聚合酶有很强的温度适应范围,但高于60℃的环境仍会使部分酶变性失活。反之,如果温度低于正常值,酶活性受到限制。而且由于引物在低温下(特别是25—27℃)可能与基因组中别的部分同源序列结合,使得一些扩增产物并非为目的序列。适当提高温度,错配碱基多会解离,反应产物特异性增加。
(二)镁离子浓度:Taq DNA聚合酶活性对Mg2+的浓度非常敏感。Taq DNA聚合酶和许多其他聚合酶一样,是Mg2+依赖性酶。用鲑鱼精DNA作模板,dNTP的总浓度为0.9~0.8mmol/L,用含不同浓泼MgCl2的PCR系统使反应进行10分钟。测定结果表明:在MgCl2为2.0mmol/L条件下,酶活性显示盈高。Mg2+浓度偏高,酶活性会受到限制,10mmol/LMgCl2使酶活性抑制约50%。由于Mg2+可以与负离子或负离子团(如根)结合,而在PCR中,DNA模板、引物以及dNTP是根的主要来源,其中dNTP占有很大比例。因此反应系统中,Mg2+的浓度还要受到dNTP浓度的影响,欲获得反应结果,要对反应条件进行必要的探索。每当一个新的目的片段和引物第yi次使用时,或者某种参数(dNTP或引物浓度)改变时,应进行Mg2+的浓度滴定。一个普遍的原则是,样品中Mg2+的浓度至少要比dNTP总浓度高0.5~1.0mmol/L。
(三)KCl的浓度:一般是50mmol/L,高于75mmol/L时,聚链反应就受到明显的限制。当KCl浓度高达200mmol/L以上时,聚链反应就受到明显的限制,此时反应进行10分钟仍无核苷掺入.浓度均为50mmol/L的NH4ClNH4Ac以及NaCl对TaqDNA聚合酶活性影响则分别为中等抑制、无影响以及25~30%促进。
(四)dNTP的浓度:均衡的低浓度dNTP更有利于酶活性的发挥,并能减少错配,获得多量的特异性强的DNA反应产物。各种核苷酸浓度为40umol/L的100ulPCR系统可以得到2.6ugDNA产物,而只消耗所提供核苷酸的半量;
(五)几种变性剂对酶活性的影响:10%乙醇尚不抑制酶活性;二甲基亚砜(DMSO),二甲替甲酰胺(DMF)。甲酰胺在低浓度时对酶活性无影响,随着它们浓度的提高,酶活性明显下降。l0%DMSO会使酶活性减半。然而另有研究者观察到,在某些聚链反应系统中,10%DMSO起着有利作用。这种结构各异的现象还表现在用尿素进行的实验中。1.0mol/L尿素能提高酶活性,2.0mol/L尿素能保存大部分酶活性。然而也有报告认为0.5mol/L尿素则*抑制PCR。总之,变性剂对TaqDNA聚合酶以及PCR系统的影响参数有待更多的实验数据。TaqDNA聚合酶对SDS十分敏感,而某些非离子型去污剂又能*消除低浓度SDS对酶活性的抑制效应。例如,0.5%Twen20及0.5%NP40可抵销0.01%SDS对酶活性的影响。

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