明胶酶谱法检测试剂盒-染色步骤很关键
本试剂盒采用凝胶反相酶谱法(Zymography)检测MMP-2、MMP-9 活性及其无活性前体酶原谱系。Zymography 是一种广为使用的、基于SDS-PAGE 电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法,其灵敏度可达1 nM,高于ELISA方法,其基本原理和程序是:制备含有胶原酶底物的SDS-PAGE凝胶,含蛋白酶的样品在此凝胶中进行电泳,电泳时SDS与样本中的MMP可逆性结合,导致MMP氢键和疏水键破坏而不能发挥分解明胶的作用。电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer孵育,MMP恢复活性,凝胶中由于含底物蛋白而被深染,形成深色背景,但在有蛋白酶条带的位置,蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白,因而不被染色而形成透亮区域,从而能同时指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶谱)及活性。本试剂盒提供MMP-2、MMP-9 特异蛋白底物及酶学反应缓冲液,可检测少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶谱及活性,检测灵敏度~1nM。试剂盒可进行25-50次标准小胶检测(如果样本MMP含量高,孵育时间短,不用换液可最多50次),如果小胶加样孔为10~15个,则总计可最多检测500~750个样品。
不同于正常血浆MMP酶谱,每种组织样品(如牙周膜韧带组织)都具有自己特定的MMP活性酶谱,部分proMMP9(92kDa)可能会结合一个25kDa微球蛋白形成MMP9复合物,条带位置约125-130kDa,其二聚体条带大约在215-225kDa位置(图中并未显现),多聚体条带位置240kDa,严格说他们都是MMP9复合体,但也有人称其为proMMP-9。注意在这种组织中activeMMP9活性低,但activeMMP2活性高,与血浆MMP活性酶谱形成了鲜明的对比
参考文献:
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