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线粒体呼吸链复合体Ⅱ检测试剂盒使用方法
发布时间:2021-09-06   点击次数:44次

线粒体呼吸链复合体Ⅱ检测试剂盒使用方法


产品说明:线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶Q还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同时辅基FAD还原为FADH2,后者进一步还原氧化型辅酶Q 生成还原型辅酶Q,是呼吸电子传递链的支路。复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶Q可进一步还原2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰,通过检测2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。


注意:实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。


需自备的仪器和用品:可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、丙酮、冰和蒸馏水。 


注意事项: 

1、 为保证实验结果的准确性,需先取1-2个样做预实验,如果测定的吸光值过高(高于1.5),可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。若ΔA大于0.4,需将样本稀释适当倍数(计算公式中乘以相应稀释倍数);若ΔA偏小,则可以通过增加加入的样本体积来提高灵敏度。

2、 样本蛋白浓度需自行测定。由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/mL),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

3、 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活,若用样本质量计算,则需加测胞浆提取物酶活,上清和沉淀酶活之和方为总酶活。 4、 本试剂盒试剂足够完成25管反应。

 5、 附:使用样本重量计算公式:(样本检测数为 25T/12S) A、上清中复合体II活力的计算: 单位的定义:每g组织在反应体系中每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。复合体II活性(U/g 质量)=[ΔA1×V反总÷(ε×d)×109]÷(W÷V提取×V样本))÷T=476.2×ΔA1÷W ΔA1:上清测定值;V反总:反应体系总体积,10-3L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V提取:加入提取液体积,1mL;V样:加入样本体积,0.05mL;T:反应时间,2min;W:样本重量,g;109:单位换算系数,1mol=109nmol。 

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